Tips：采集外周血的抗凝管必须是肝素抗凝管，刺激剂尽量选用冻干粉自己配置；cocktail刺激剂是液体形式，PMA会因保存不当导致活性降低，影响刺激效果，而冻干粉形式的PMA较稳定，可以刺激效果。
1、收集细胞于流式管内，500 g/8min离心，枪头吸去上清，弹散管底沉淀，加入相应的表面染色抗体（CD3\CD8），弹散混匀。室温避光孵育15分钟后，500 g/8min离心，枪头吸去上清；
3、室温避光孵育30分钟， 600 g/10min离心，在吸水纸上倒扣流式管弃去上清（此时细胞已在管底形成很牢固的沉淀，不容易丢 失），弹散管底沉淀；
4、加入1ml Permeabilization Buffer(此为10X，须与蒸馏水1：10稀释成工作液)工作液离心洗涤细胞，破膜15分钟（室温避光）， 600 g/10min，在吸水纸上倒扣流式管弃去上清，弹散管底沉淀；
Tips：1、根据实验需求选择相应的抗体，并做单染管用于调节补偿（具体如何设置单染管，可参照后文中补偿章节的介绍）。
2、尽量做同型对照，因细胞因子表达量不高（尤其是IL-4表达量非常低），细胞因子抗体对应的同型对照一般都要做。
3、PMA刺激会导致人T细胞表面CD4表达的下调，PMA与Lonomycin联合刺激下调非常明显，4h刺激后会下调50%以上，6h刺激几乎检测不到CD4，因此我们的界定CD4+T细胞是通过染CD3和CD8，来圈CD3+CD8-的细胞。
5、因破膜剂对细胞损伤较大，离心后形成的细胞沉淀先弹散形成细胞悬液，在加入破膜剂，这样会减少对细胞的损伤（形成的细胞碎片较少）。
注意：细胞破膜后对形态影响较小，因此可以直接圈淋巴门分析，在通过圈CD3+CD8-的细胞（此处未列出图）来分析CD4+的细胞表达细胞因子的量。因此此图横坐标就直接标的CD4。
Th细胞是适应性免疫应答主要参与者。传统观念根据Th细胞分泌的细胞因子不同将其分为两型：一型能产生IFN-г的Th1细胞，在介导细胞免疫应答中起重要作用；另一型能产生IL-4的Th2细胞，它们与体液免疫应答有关。Th1／Th2细胞由共同前体细胞即CD4+T细胞分化而来，CD4+T细胞活化后，在IL-l2的作用下向Thl细胞分化。IL-l2是CD4+T细胞分化为Th1细胞的决定因子。IL-l2与IL-12R结合后信号转导和STAT4的活化，可上调IFN-г，进而活化STAT1，并Th1细胞分化性地因子T-bet。活化的CD4+T细胞在IL-4作用下向Th2细胞分化。
Ionomycin离子霉素是Streptomyces conglobatus细菌生成的一种离子载体。用来提高胞内钙离子浓度，了解钙离子跨膜转运机制。也可用于刺激以下胞内因子产生：干扰素，穿孔素 ，IL-2和 IL-4，一般和佛波酯联合使用。这些细胞因子在炎症反应中有重要作用。
BrefeldinA布雷菲尔德菌素A通过间接COP-I与高尔基膜的连接，内质网到高尔基体的蛋白质转运。
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